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  • Y187 Chemically Competent Cell

    價格:1000元

    聯系方式:I47-825O-882O

    買家導航

    Y187感受態細胞基本信息

    出品公司: 生物風
    感受態細胞名稱: Y187  Ultracompetent cells;Y187
    菌種類型: E.coli
    產品規格: 10X100 微升
    轉化效率: 大于1X10的9次方
    基因型: MATαura3-52his3-200ade 2-101trp 1-901leu 2-3112gal4Δmet-gal80Δ, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZMEL1
    抗性: 無抗性
    質粒轉化條件: 42 ℃熱激
    生長條件: 37 ℃,  有氧
    用途: 非毒性蛋白表達。
    儲存條件: -80 ℃或者更低溫度保存,避免反復凍融。

    感受態細胞特點和簡介

    Y187菌株是Clontech公司開發的GAL4系統酵母單雜,雙雜實驗用菌株,MATα型,可直接轉化質;蚺cMATa型酵母菌株 (Y2HGold,AH109等)通過mating操作進行篩庫試驗。Transformation marker為: trp1, leu2,報告基因為:lacZ,MEL1。Y187-GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用:pGBKT7和pGADT7。質粒pGBKT7的篩選標志為TRP1,用于表達DNA-BD (來自酵母轉錄因子GAL4N端1~174位氨基酸)與目標蛋白 (Bait)的融合蛋白;質粒pGADT7的篩選標志為LEU,用于表達AD (GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系統原理:一個完整的酵母轉錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結構域:位于N端1~174位氨基酸區段的DNA結合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區段的轉錄激活域 (AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并與之結合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD單獨存在不能激活轉錄,但當二者接近時,則呈現完整的GAL4活性,使含有UAS的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下,BD不與AD結合,將要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合,形成 bait融合蛋白 (bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和 prey發生相互作用,就會促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,從而激活報告基因的轉錄。Y187有兩個報告基因:lacZ,MEL1,分別由兩種不同的啟動子 (G1,M1)啟動,這兩種啟動子只有GAL4識別的17 bp核心區相同,其余部分均不同,大大降低了酵母雙雜假陽性發生的概率。Y187感受態細胞經特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。

    感受態細胞制備方法

    生物風在氯化鈣感受態細胞制作方法的基礎上進行了改良,采用最新的二價錳法感受態細胞制備方法,制備得到Y187超級感受態細胞(Ultracompetent cell)。轉化效率是常規氯化鈣制備法的10倍。
     

    感受態細胞操作方法

     
    1. 取Y187感受態細胞置于冰浴中,如需分裝可將剛融化細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中,置于冰浴中。
         注意:一次轉化Y187感受態細胞的建議用量為 50-100μl,可以根據實際情況分裝使用。應注意所用DNA 體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一。以下實驗以100μl Y187感受態細胞為例。 
     
    2. 向Y187感受態細胞懸液中加入目的 DNA (100μl 的感受態細胞能夠被1 ng 超螺旋質粒DNA 所飽和),輕彈混勻,在冰浴中靜置30 分鐘。  
     
    3. 將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒,然后快速將管轉移到冰浴中,使Y187感受態細胞冷卻2-3分鐘,該過程不要搖動離心管。
     
         注意:此步驟也可將離心管置于室溫進行,時間不需十分準確,夏季或室溫較高時,可放置5-8分鐘左右;如果室溫較低,可延長時間至8-15分鐘左右。條件允許建議使用 42 ℃ 熱激方法。  
     
    4. 向每個離心管中加入900 μl無菌的SOC 或LB 培養基(不含抗生素),混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養45 分鐘(150 rpm),目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。 
     
    5. 將離心管內容物混勻,吸取100μl已轉化的Y187感受態細胞加到含相應抗生素的SOB或者LB 固體瓊脂培養基平板上,用無菌的彎頭玻棒涂布器或玻璃珠將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被完全吸收后,倒置平板,37 ℃培養12-16 小時。 
         注意:涂布用量可根據具體實驗來調整。如轉化質?偭枯^多,可取更少轉化產物涂布平板;反之,如轉化的質?偭枯^少,可取200-300 μl轉化產物涂布平板;對于連接產物的轉化菌液,可以通過離心(4000 rpm,2分鐘)后倒掉大部分培養液上清,吹打懸浮菌體后,將其涂布于一個平板中。  
     
    6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存,如果次日的轉化菌落數過少,可以將剩下的菌液再涂布新的培養平板。

    感受態細胞注意事項

    1. Y187感受態細胞應保存在-70 ℃,不可反復凍融和放置時間過長,以免降低感受態細胞的轉化效率。
     
    2. 進行轉化操作時,應根據相應的溫度及無菌條件的要求進行。
     
    3. 為防止轉化實驗不成功,可以保留部分連接反應液,以重新轉化,將損失降到最低。
     
    4. 用于轉化的連接產物或質粒的體積不能超過感受態細胞體積的15%.  
     
    5. 質粒超過7.5 kb后,隨尺寸的增加轉化效率會下降,質粒的尺寸超過10 kb時,在大腸桿菌增殖過程中也可能會出現質粒缺失現象;  
     
    6. 用于轉化的質粒量在0.1 pg~50 ng間的效果最好,超過50 ng質粒時,平板上單克隆數目會增加,但是轉化效率會下降。 
     
    7. 42 ℃熱擊時間與離心管的厚度、菌液的體積、轉入片段的大小直接相關,一般建議熱擊60-90秒,熱擊時間不宜超過90秒,否則轉化效率會下降很快; 
     

    Y187感受態細胞特點和簡介

    Y187感受態細胞制備方法

    Y187感受態細胞操作方法

    Y187感受態細胞注意事項

    Y187感受態細胞說明書pdf版和相關資料下載

    Y187感受態細胞應用舉例

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